脂肪干細(xì)胞(ADSCs)原代培養(yǎng)實驗指南

脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived Stem Cells, ADSCs)是來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能
。以下是脂肪干細(xì)胞原代培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程：

一、實驗前準(zhǔn)備

材料與試劑

• ?實驗動物?：4周齡雄性Wistar/SD大鼠或C57BL/6小鼠

• ?基礎(chǔ)試劑?：

• PBS緩沖液(不含Ca2?/Mg2?)

• 0.075%-0.1%Ⅰ/Ⅱ型膠原酶消化液

• DMEM/F12或低糖DMEM培養(yǎng)基

• 10%胎牛血清(FBS)

  
  

儀器設(shè)備

• 超凈工作臺

• CO?培養(yǎng)箱(37℃,5%CO?)

• 離心機(jī)

• 200目尼龍篩網(wǎng)

二、操作流程

1. 取材與處理

• 處死動物后，75%酒精浸泡消毒2-3分鐘

• 無菌條件下取腹股溝/附睪周圍脂肪墊

• PBS沖洗3次去除血液和雜質(zhì)

• 眼科剪剪碎至1-2mm3大小

2. 消化分離

• 加入5ml 0.1%膠原酶(37℃消化30-40分鐘)

• 每5分鐘震蕩一次

• 或使用恒溫水浴振蕩器

• 加入等體積含血清培養(yǎng)基終止消化

• 200目篩網(wǎng)過濾去除未消化組織

• 1200g離心10分鐘

• 棄上層脂肪和上清

• 沉淀為基質(zhì)血管成分(SVF)

3. 細(xì)胞接種

• 用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞

• 按1×10?-5×10?個/cm2密度接種

• 37℃、5%CO?培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)

三、培養(yǎng)維持

換液與觀察

• 24小時后換液去除未貼壁細(xì)胞

• 之后每2-3天換液一次

• 倒置顯微鏡觀察：

• 初期可見梭形/多角形細(xì)胞

• 3-5天形成克隆樣集落

傳代培養(yǎng)

• 80%匯合時傳代

• 0.25%蛋白酶+0.02%EDTA消化3分鐘

• 按1:2比例分瓶

四、注意事項

1. ?無菌操作?：全程在超凈臺內(nèi)完成

2. ?消化控制?：過度消化會導(dǎo)致細(xì)胞損傷

3. ?污染預(yù)防?：培養(yǎng)基添加雙抗

4. ?細(xì)胞鑒定?：傳代后檢測CD29/CD44等表面標(biāo)志物

5. ?分化潛能?：3代內(nèi)細(xì)胞保持最佳分化能力

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