AO/EB染色實(shí)驗(yàn)是一種通過熒光染料區(qū)分細(xì)胞存活狀態(tài)的經(jīng)典方法，主要用于細(xì)胞凋亡與壞死的鑒別
。以下是實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵信息：

一、實(shí)驗(yàn)原理

1. ?染料特性?

• ?AO（吖啶橙）?：穿透完整細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合發(fā)綠色熒光，與RNA結(jié)合發(fā)紅色熒光

• ?EB（溴化乙錠）?：僅進(jìn)入膜損傷細(xì)胞，與DNA結(jié)合發(fā)橘紅色熒光

2. ?染色結(jié)果判讀?

   細(xì)胞狀態(tài)	核染色特征	熒光顏色
   正常活細(xì)胞	均勻綠色	黃綠色（核）/紅色（胞質(zhì)）
   早期凋亡細(xì)胞	核固縮呈串珠狀或塊狀	綠色熒光亢進(jìn)
   晚期凋亡細(xì)胞	核碎裂或凋亡小體	橙紅色
   壞死細(xì)胞	細(xì)胞腫脹，核輪廓模糊	不均勻橙紅色

二、實(shí)驗(yàn)步驟（以貼壁細(xì)胞為例）

1. ?細(xì)胞處理?

• 誘導(dǎo)凋亡后消化細(xì)胞，制備1×10?/mL單細(xì)胞懸液

2. ?染色操作?

• 取25μL細(xì)胞懸液，加入2μL AO（100μg/mL）和2μL EB（100μg/mL）

• 混勻后滴片，加蓋玻片避光孵育1分鐘

3. ?觀察記錄?

• 熒光顯微鏡下20分鐘內(nèi)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞（藍(lán)光激發(fā)綠熒光，綠光激發(fā)紅熒光）

三、注意事項(xiàng)

1. ?染色控制?

• AO/EB終濃度建議50μg/mL，避免過度染色

• 需設(shè)置未處理細(xì)胞對(duì)照和凋亡誘導(dǎo)陽性對(duì)照

2. ?結(jié)果分析?

• 早期凋亡需與活細(xì)胞區(qū)分：觀察核固縮形態(tài)

• 壞死細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大和熒光彌散

四、應(yīng)用案例

• 肝癌細(xì)胞凋亡檢測(cè)中，AO/EB染色與TUNEL法結(jié)果一致性較高

• 骨肉瘤細(xì)胞凋亡研究中，該方法可定量分析不同凋亡階段細(xì)胞比例

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